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【留学生论文】浅析大鲵虹彩病毒的PCR检测及初步应用(论文材料)

星级: ★★★★★ 期刊: 《河北渔业》作者:沈红保,张建军,张军燕,等浏览量:2203 论文级别:热门本章主题:病毒和虹彩原创论文: 5156论文网更新时间:12-22审核稿件编辑:Ives本文版权归属:www.5156chinese.cn 分享次数:4674 评论次数: 2391

导读:怎么写作好病毒和虹彩相关方面的论文。本篇大鲵虹彩病毒的PCR检测及初步应用中的相关论文的格式要求希望会对你的写作带来参考帮助以解你的写作忧愁。

(中国水产科学研究院黄河水产研究所,陕西 西安 710086)

摘要:通过了解大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)在EPC细胞接毒情况和PCR的实际检测情况,为大鲵的病毒检测提供必要判断依据和检测方法.通过细胞接毒和组织分离分别提取病毒质粒,进行普通PCR扩增,电泳分析,比较病毒细胞培养和组织直接提取结果.Gsiv病毒体外培养:经传代48 h的EPC细胞,25 ℃培养,12 h后可观察到CPE出现,24 h病变明显,CPE达15%,48 h后CPE可达70%,72 h后细胞完全脱落;PCR检测:对3个样本分别从组织提取和经细胞扩增分离的病毒进行普通PCR扩增检测,经细胞培养扩增的3个样本全部呈阳性;经组织提取的3个样本,2个呈阳性,一个呈阴性;电泳观察,病毒的扩增产物在500 bp左右.在体外环境下GSIV是高病力的一种病毒,对EPC细胞在25 ℃时效应时间为3 d,普通PCR经组织的检出率低,经细胞培养扩增可提高检出率但耗时久,不利于实际生产中快速、准确诊断疫情的需要.

关键词:大鲵;虹彩病毒;PCR

大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)是蛙病毒(Ranavirus)虹彩病毒科(Iridoviri-dae)中的一种,为双链DNA病毒,主要可感染鱼类、两栖类和爬行类等低等脊椎动物[1-2].全世界已发现的虹彩病毒超过60余种,分4个属:虹彩病毒属(Iridovirus),绿虹彩病毒属(Chlorirdovirus),淋巴囊肿病毒属(Lympocystivirus),蛙病毒属(Ranavirus)[3-4].已见报道的水生动物虹彩病毒中,有来源于鱼类的传染性造血器官坏死病毒(Epizootichematopoietic necrosis virus, EHNV)、真鲷虹彩病毒(Redsea bream iridovirus,

大鲵虹彩病毒的PCR检测及初步应用
病毒和虹彩论文的格式要求

RSIV)、非洲鱼虹彩病毒(Africanlampeye iridovirus, ALIV)、虹鳟鱼病毒(Rainbow troutvirus, RTV)、欧鲇病毒(European sheatfish virus, ESV)、欧洲鲶鱼病毒(European catfish virus, ECV)、大口鲈鱼病毒(Largemouth bass virus, LMBV)、黄鲶虹彩病毒(Grouper iridovirus,GIV);也有来源于两栖类的饰纹汀蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus, BIV)、蛙虹彩病毒(Ranagrylio virus, RGV) 、虎纹蛙病毒(Tiger frog virus, TFV);以及来源于爬行类的TV3( Box turtle 3) 和TV5(Tortoisevirus 5) 等[5-14].大鲵虹彩病毒10~30 ℃能在CIK(Ctenopharyngodon idellus Kidney Cells)、EPC(Carp Intestinal Epithelial Cells)、CHSE(Chinook Salmon Embryo Cells )等细胞中较好地增殖,最适生长温度为25~30 ℃[15].患病大鲵皮肤出现白点、出血斑、溃疡,四肢肿胀、溃烂和头部肿胀为主要特征,其感染率和死亡率都很高,仅陕西一年因病害造成的损失高达亿元.

1材料与方法

1。1标准病毒株

GSIV标准病毒由中国水产科学研究院长江水产研究所病害研究室提供,经EPC (Carp Intestinal Epithelial Cells) 细胞25 ℃ 接毒培养扩增,收集鉴定保存.

1。2实验材料

病体样本来自陕西汉中一大鲵养殖场,患病大鲵体表溃疡,肢体远端溃烂,四肢肿大为主要临床特征,取样部位是样本个体的肾脏组织.

1。2。1样品处理

①取0。1 g病体样本的肾脏组织,加10 mL液氮冷冻,研磨匀浆;

②用0。22 μm的一次性滤器过滤,吸收滤液;

③-80 ℃ 冷冻2 h,室温溶解,4 000 r/min离心,20 min;

④取上清液分装200 μL,-20 ℃保存备用.

1。2。2病毒分离

①直接取样品处理的上清液作为组织提取直接应用.

②将分离出的病毒液0。1 mL,接种到培养48 h的EPC (Carp Intestinal Epithelial Cells)细胞中,吸附1 h,用不含胎牛血清的MEM培养液于25 ℃培养,做空白对照,定时观察病变,72 h病变细胞完全脱落,收毒.

1。3DNA提取

备用样品从-20 ℃冰箱取出,按照病毒DNA小剂量抽提试剂盒(上海生工生物公司)的说明书分别提取组织和细胞分离病毒的DNA.

1。4引物设计

利用生物信息学软件DNA Star,根据长江所提供大鲵彩虹病毒(GSIV)基因序列,合成引物F1: 5′-GAC TTG GCC ACT TAT GAC-3′;

R1: 5′-GTC TCT GGA GAA GAA GAA -3′,靶序列的大小约为500 bp.引物由北京天一辉远生物工程有限公司合成.

1。5PCR体系及反应条件

PCR体系为25 μL:DNA模板3 μL, PCR Master Mix(2x) 10 μL,引物0。5 μL,水11。5 μL.

反应条件:95 ℃预热处理5 min,进行35个循环,每个循环反应包括95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循环完成后,72 ℃延伸10 min.

1。6阳性对照

阳性对照选用从长江所带回的GSIV标准病毒.

1。7PCR扩增产物的检测

PCR产物经1。5%进口生物学级琼脂糖凝胶电泳,电解液采为0。5 TBE,电压5 V/cm,经1 h后,用Gene-Genius凝胶成像系统拍照.

2结果分析

2。1病毒培养

从组织提取的病毒经EPC细胞在25 ℃培养,12 h后可观察到病变细胞,24 h病变明显,病变细胞达15%,48 h后病变细胞可达70%,72 h后细胞完全脱落.见图1.

2。2PCR结果

2。2。1病毒的PCR检测对3个样本分别从组织和经细胞扩增分离的病毒进行普通PCR扩增.电泳观察,病毒的扩增产物在500 bp左右.其中3号样的组织毒经PCR检测现阴性,经细胞培养检测呈阳性.

1:阴性对照;2:标准病毒扩增结果;M:Marker DL2000;3:3号组织提取扩增结果;4:3号经细胞扩增后结果.

2。2。2与标准病毒的对比3号样经组织提取和细胞扩增后的病毒与长江所带回的标准病毒进行PCR扩增.电泳观察,细胞扩增产物与标准病毒的大小相同,均在500 bp左右,而组织提取的扩增后为阴性.

3讨论

组织上清液未检出的样本不能作为阴性样本,应接种到细胞进行病毒扩增,再进行检测.分析其原因是组织的病毒含量底,超出普通PCR的检测范围,因此会出现假阴性.

大菱鲆红体虹彩病毒0。2 mL接种到FG(牙鲆鳃细胞)细胞中,吸附2 h,用含有10%胎牛血清的MEM培养液于22 ℃培养,第4 d收获[16].这与本次试验用病毒液0。1 mL,接种到EPC细胞中,吸附1 h,用不含胎牛血清的MEM培养液于25 ℃培养,72 h病变完全使细胞脱落的结果相近,都是高致病、感染力强、爆发性强的病毒.

普通PCR虽然可以检测出,但组织提取液的检出率低,细胞扩增检测出率提高了,但一般需要2 d以上,耗费时间长.因此,在实际检测和应用中应寻求更快速、简便、准确的诊断技术,应进一步改进

病毒专业留学生论文怎么写
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检测方法.根据张旻的研究,蛙虹彩病毒巢式PCR检测方法可同时检测EHNV、STIV
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和TFV 3种蛙虹彩病毒,最低可以检测102拷贝数的病毒粒子,是普通PCR的100倍

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,而且与其他非蛙虹彩病毒无交叉反应,效果良好[3].因此,大鲵虹彩病毒可以尝试采用巢式PCR进行快速检测.

[ 参考文献 ]

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